Лаборатория молекулярной физиологии клетки
Реконструкция сигнальных процессов в модельных системах

Основные научные результаты

Работы выполнялись при финансовой поддержке РФФИ, РНФ, Министерства образования и науки РФ, фондами CRDF и HHMI, в рамках программ Президента РФ и Президиума РАН.

Клеточные и генетически-кодируемые сенсоры

Клеточные биосенсоры для анализа секреции сигнальных молекул

Во вкусовой почке идентифицированы множественные первичные медиаторы, которые, видимо, вовлечены в межклеточные коммуникации. Это ставит вопрос о том, какие типы вкусовых клеток распознают и секретируют ту или иную сигнальную молекулу. Для анализа секреции первичных медиаторов нами разрабатывался метод клеточного биосенсора. Суть этого подхода состоит в том, что для мониторинга сигнальной молекулы в экстраклеточном пространстве используются клетки, которые эндогенно или экзогенно экспрессируют молекулярный рецептор исследуемого соединения, сопряженный с мобилизацией Са2+. Локальный выброс сигнальной молекулы приводит к генерации Са2+ сигнала в клетке-сенсоре. В частности, для мониторинга секреции АТР использовались клетки линии COS-1 (Рис.1i), в которых функционируют метаботропные P2Y рецепторы.

Рисунок 1. Анализ секреции АТР вкусовыми клетками методом клеточного биосенсора. (i) Взаимное расположение вкусовой клетки типа II, активность которой регистрируется пэтч-электродом, и клеток АТР-сенсоров (COS-1), загруженных Са2+ зондом Fluo-4. Изображение получено в проходящем свете. (ii)- (iv) Флуоресцентное изображение той же группы клеток при различной поляризации вкусовой клетки. (ii) При -70 мВ на мембране вкусовой клетки уровень флуоресценции клеток АТР-сенсоров низок, свидетельствуя об отсутствие секреции АТР. (iii) Кратковременная (10 с) деполяризация вкусовой клетки до 20 мВ стимулировала выброс АТР, что приводило к повышение уровня Са2+ в АТР-сенсорах, который возвращался к исходному уровню после ее реполяризации вкусовой клетки (iv).

Для мониторинга секреции серотонина вкусовыми клетками типа III был клонирован рецептор 5-НТ2С и гетерологически экспрессирован в клетках линии CHO. Методами проточной цитофлуориметрии были получены клеточные моноклоны с высоким и постоянным уровнем экспрессии рецептора 5-НТ2С. С использованием микрофотометрии (Ca2+ imaging) были отобраны клоны с чувствительностью к внеклеточному серотонину порядка 1 нМ. Это позволило проанализировать закономерности секреции серотонина вкусовыми клетками (Рис.2).

Рисунок 2. Анализ секреции серотонина вкусовыми клетками типа III методом клеточного биосенсора. Вкусовая клетка поддерживалась при -70 мВ и периодически деполяризовалась в течении 2 с серией 10 мс импульсов до 0 мВ (верхняя панель). Нижняя панель, ответы клетки-сенсора, загруженной Са2+ зондом Fluo-4, на деполяризацию вкусовой клетки. Взаимное расположение вкусовой клетки типа III, активность которой контролировалась пэтч-электродом, и клеток-сенсоров как на Рис.1i.

Генетически-кодируемые сенсоры

Многие внешние стимулы мобилизуют внутриклеточный Са2+, поэтому Са2+ зонды и микрофотометрия (Ca2+ imaging) традиционно используются для исследования процессов трансдукции. Между тем, внутриклеточная сигнализация представляет собой весьма разветвленную систему сигнальных и регуляторных каскадов, взаимодействие между которыми невозможно однозначно восстановить путем мониторинга только одного параметра - внутриклеточного Са2+. Разработанные в последние годы генетически-кодируемые сенсоры внутриклеточных сигнальных молекул значительно расширяют возможности эксперимента. Нами начаты работы по созданию моноклональных клеточных линий, клетки которых экспрессируют в различных комбинациях множественные генетически-кодируемые сенсоры для одновременного мониторинга Са2+, cAMP, cGMP, IP3, PIP3. В частности, нами получены клоны клеток HEK-293, которые экспрессируют сенсор цитозольного Са2+ GEM-GECO1, флуоресцирующий в зеленой области, и сенсор ретикулярного Са2+ R-CEPIA1er, флуоресцирующий в красной области. Благодаря спектральному разнесению, эти генетически-кодируемые сенсоры обеспечивают возможность одновременного мониторинга цитозольного и ретикулярного Са2+ (Рис.3).

Рисунок 3. Ca2+-ответы клеток моноклональной линии GEM-GECO1/R-CEPIA1er. Репрезентативная регистрация Ca2+-сигналов, инициируемых ацетилхолином, в одиночной клетке, экспрессирующей сенсоры цитозольного и ретикулярного Са2+. Зеленая и красная кривые соответствуют одновременной регистрации флуоресценции GEM-GECO1 и R-CEPIA1er сенсоров, представленной как DF/F0, где F0 – средняя интенсивность флуоресценции в начальный момент регистрации. В случае R-CEPIA1er, DF= F-F0, F – текущая интенсивность флуоресценции. Поскольку флуоресценция GEM-GECO1 падает с повышением Са2+, для него DF= F0-F.