Лаборатория молекулярной физиологии клетки
Реконструкция сигнальных процессов в модельных системах

Основные научные результаты

Работы выполнялись при финансовой поддержке РФФИ, РНФ, Министерства образования и науки РФ, фондами CRDF и HHMI, в рамках программ Президента РФ и Президиума РАН.

Клеточные и генетически-кодируемые сенсоры

Клеточные биосенсоры для анализа секреции сигнальных молекул

Во вкусовой почке идентифицированы множественные первичные медиаторы, которые, видимо, вовлечены в межклеточные коммуникации. Это ставит вопрос о том, какие типы вкусовых клеток распознают и секретируют ту или иную сигнальную молекулу. Для анализа секреции первичных медиаторов нами разрабатывался метод клеточного биосенсора. Суть этого подхода состоит в том, что для мониторинга сигнальной молекулы в экстраклеточном пространстве используются клетки, которые эндогенно или экзогенно экспрессируют молекулярный рецептор исследуемого соединения, сопряженный с мобилизацией Са2+. Локальный выброс сигнальной молекулы приводит к генерации Са2+ сигнала в клетке-сенсоре. В частности, для мониторинга секреции АТР использовались клетки линии COS-1 (Рис.1i), в которых функционируют метаботропные P2Y рецепторы.

Рисунок 1. Анализ секреции АТР вкусовыми клетками методом клеточного биосенсора. (i) Взаимное расположение вкусовой клетки типа II, активность которой регистрируется пэтч-электродом, и клеток АТР-сенсоров (COS-1), загруженных Са2+ зондом Fluo-4. Изображение получено в проходящем свете. (ii)- (iv) Флуоресцентное изображение той же группы клеток при различной поляризации вкусовой клетки. (ii) При -70 мВ на мембране вкусовой клетки уровень флуоресценции клеток АТР-сенсоров низок, свидетельствуя об отсутствие секреции АТР. (iii) Кратковременная (10 с) деполяризация вкусовой клетки до 20 мВ стимулировала выброс АТР, что приводило к повышение уровня Са2+ в АТР-сенсорах, который возвращался к исходному уровню после ее реполяризации вкусовой клетки (iv).

Для мониторинга секреции серотонина вкусовыми клетками типа III был клонирован рецептор 5-НТ2С и гетерологически экспрессирован в клетках линии CHO. Методами проточной цитофлуориметрии были получены клеточные моноклоны с высоким и постоянным уровнем экспрессии рецептора 5-НТ2С. С использованием микрофотометрии (Ca2+ imaging) были отобраны клоны с чувствительностью к внеклеточному серотонину порядка 1 нМ. Это позволило проанализировать закономерности секреции серотонина вкусовыми клетками (Рис.2).

Рисунок 2. Анализ секреции серотонина вкусовыми клетками типа III методом клеточного биосенсора. Вкусовая клетка поддерживалась при -70 мВ и периодически деполяризовалась в течении 2 с серией 10 мс импульсов до 0 мВ (верхняя панель). Нижняя панель, ответы клетки-сенсора, загруженной Са2+ зондом Fluo-4, на деполяризацию вкусовой клетки. Взаимное расположение вкусовой клетки типа III, активность которой контролировалась пэтч-электродом, и клеток-сенсоров как на Рис.1i.

Генетически-кодируемые сенсоры

Многие внешние стимулы мобилизуют внутриклеточный Са2+, поэтому Са2+ зонды и микрофотометрия (Ca2+ imaging) традиционно используются для исследования процессов трансдукции. Между тем, внутриклеточная сигнализация представляет собой весьма разветвленную систему сигнальных и регуляторных каскадов, взаимодействие между которыми невозможно однозначно восстановить путем мониторинга только одного параметра - внутриклеточного Са2+. Разработанные в последние годы генетически-кодируемые сенсоры внутриклеточных сигнальных молекул значительно расширяют возможности эксперимента. Нами начаты работы по созданию моноклональных клеточных линий, клетки которых экспрессируют в различных комбинациях множественные генетически-кодируемые сенсоры для одновременного мониторинга Са2+, cAMP, cGMP, IP3, PIP3. В частности, нами получены клоны клеток HEK-293, которые экспрессируют сенсор цитозольного Са2+ GEM-GECO1, флуоресцирующий в зеленой области, и сенсор ретикулярного Са2+ R-CEPIA1er, флуоресцирующий в красной области. Благодаря спектральному разнесению, эти генетически-кодируемые сенсоры обеспечивают возможность одновременного мониторинга цитозольного и ретикулярного Са2+ (Рис.3).

Рисунок 3. Ca2+-ответы клеток моноклональной линии GEM-GECO1/R-CEPIA1er. Репрезентативная регистрация Ca2+-сигналов, инициируемых ацетилхолином, в одиночной клетке, экспрессирующей сенсоры цитозольного и ретикулярного Са2+. Зеленая и красная кривые соответствуют одновременной регистрации флуоресценции GEM-GECO1 и R-CEPIA1er сенсоров, представленной как DF/F0, где F0 – средняя интенсивность флуоресценции в начальный момент регистрации. В случае R-CEPIA1er, DF= F-F0, F – текущая интенсивность флуоресценции. Поскольку флуоресценция GEM-GECO1 падает с повышением Са2+, для него DF= F0-F.

Лаборатория молекулярной физиологии клетки
Сигнальные процессы в клетках

Основные научные результаты

Работы выполнялись при финансовой поддержке РФФИ, РНФ, Министерства образования и науки РФ, фондами CRDF и HHMI, в рамках программ Президента РФ и Президиума РАН.

Молекулярные и клеточные механизмы вкуса

Периферическая вкусовая система обеспечивает мозг информацией для принятия жизненно важного решения о потреблении или избегании пищи. Функциональной единицей вкусовой системы млекопитающих является вкусовая почка – плотная группа из 50–80 клеток различного типа, включая вкусовые клетки типа I, II и III. Эти клетки отличаются морфологически, функционально и по спектру генов, вовлеченных в сенсорные функции. Исследование процессов вкусовой трансдукции и межклеточных коммуникаций во вкусовой почке является одним из основных направлений лаборатории. В последние годы в этой области были получены следующие основные результаты.

Неканоническая афферентная нейропередача вкусовых клеток типа II

Вкусовые клетки типа II являются основными хемосенсорными клетками, специализируюшимися на распознавании горьких и сладких соединений и аминокислот. Эти вкусовые клетки не формируют классические химические синапсы, и долгое время было не ясно, каким образом сенсорная информация передается этими клетками афферентному вкусовому нерву. В лаборатории были выполнены пионерские исследования по анализу молекулярной организации и принципов функционирования афферентного синапса в клетках типа II, который, как оказалось фундаментально отличаются от канонического синапса в других сенсорных клеток. У последних сенсорная информация кодируется путем секреции афферентного нейротрансмиттера глутамата с использованием Са2+-зависимого экзоцитоза. Вкусовые клетки типа II в ответ на вкусовую стимуляцию выбрасывают афферентный нейротрансмиттер АТР при участии АТР-проницаемых ионных каналов CALHM1. Локальный выброс АТР стимулирует P2X пуринорецепторы, функционирующие в окончания вкусового нерва (Рис.1).

Рисунок 1. Механизм вкусовой трансдукции в клетках типа II. Вкусовой GPCR-рецептор сопряжен G-белком с фосфолипазой Сb2 и IP3-зависимым выбросом депонированного Са2+. Вкусовая стимуляция инициирует повышение цитозольного Са2+, активацию Са2+-зависимого катионного канала TRPM5, с последующими деполяризацией, генерацией серии потенциалов действия (ПД) и выбросом АТР через потенциал-зависимый АТР-проницаемый канал CALHM1. Клетка типа I формирует экстраклеточный синаптический компартмент и предотвращает спиловер АТР, создавая диффузионный барьер и экспрессируя эктонуклеотидазу NTPD2.

Использование АТР-проницаемого ионного канала для секреции АТР ассоциируется с несколькими проблемами. Во-первых, для эффективного транспорта АТР пора такого канала должна иметь достаточно большой диаметр – 14 Å в случае CALHM1. Секреция АТР поэтому должна сопровождаться потерей таких метаболитов, как cAMP, IP3, NAD+, а также массированным входом внеклеточного Са2+, что чревато апоптозом. Кроме того, при физиологических градиентах поток АТР из клетки пропорционален концентрации АТР в окрестности устья АТР-проницаемого канала. Поскольку уровень АТР в клетке варьирует при изменении активности многочисленных АТР-аз, киназ и других АТР-зависимых ферментов, то высвобождаемый АТР должен быть компартментализован, чтобы афферентная нейропередача не зависела от клеточного метаболизма. Оказалось, что такой компартмент действительно существует. Клетки типа II содержат атипичную митохондрию, примыкающую к плазматической мембране в месте ее сопряжения с нервным окончанием (Рис.2А), где функционируют АТР-проницаемые каналы, собранные в кластер. Эта митохондрия образует внутриклеточный пресинаптический компартмент, который, создает физический барьер для диффузионного обмена с цитоплазмой, в котором, по-видимому, поддерживается не зависящий от остальной части клетки уровень секретируемого АТР (Рис.2Б).

Рисунок 2. Пресинаптический компартмент во вкусовых клетках типа II. (А) Электронно-микроскопическое изображение атипичной митохондрии со-локализованной с нервным окончанием. (Б) Схема организации афферентного синапса в клетке типа II. Кластер АТР-проницаемых каналов CALHM1 изолирован атипичной митохондрией, которая является источником секретируемого АТР и предотвращает перегрузку клетки Са2+ входящим через CALHM1. Здесь, Un – митохондриальный Са2+ унипортер, PMCA – Са2+-АТРаза плазмолеммы.

Потенциал-зависимость секреции АТР

Вкусовые клетки типа II электрически возбудимы, и потенциал действия (ПД) инициирует выброс нейротрансмиттера АТР. Между тем, другие сенсорные клетки, которые подобно вкусовым не имеют аксона (фоторецепторы, волосковые клетки органа Корти), электрически не возбудимы и используют градуальный рецепторный потенциал для регуляции секреции афферентного нейротрансмитера. В свете этого факта физиологическая целесообразность электрической возбудимости клеток типа II неясна. В качестве возможной причины нами рассматривались особенности синаптической передачи в клетках типа II, в частности, потенциал-зависимость секреции АТР. Последняя анализировалась экспериментально методом АТР-биосенсора и теоретически путем математического моделирования.

С использованием формализма Гольдмана-Ходжкина-Каца была разработана модель транспорта АТР через АТР-проницаемый канал и получены транспортные уравнения для анализа потенциал-зависимости выброса АТР через ионный канал CALHM1, характеризуемый медленной деактивацией. Последнее предопределяет разный тип потенциал-зависимости секреции АТР при короткой и длительной деполяризации клетки. Моделировался выброс АТР под действием короткого деполяризующего импульса, имитирующего потенциал действия, и под действием длительного импульса, как в случае градуального рецепторного потенциала. При реалистичных значениях параметров модель весьма точно описывала потенциал-зависимость выброса АТР при продолжительной (Рис.3А) и короткой (Рис.3В) электрической стимуляции. Следует отметить, что рецепторный потенциал, который генерируется в процессе вкусовой трансдукции за счет активации неселективных катионных каналов TRPM5, принципиально не может превышать 0 мВ. Характеризуемый резкой потенциалзависимостью CALHM1 обеспечивает заметный выход АТР только при деполяризации выше -10 мВ (Рис.3А). В силу этого, градуальный рецепторный потенциал является крайне неэффективным регулятором синаптической передачи, основанной на выбросе АТР, поскольку последний практически отсутствует в области от потенциала покоя -55 мВ до примерно -10 мВ (Рис.3А, оранжевая панель). Скорее всего, именно поэтому вкусовые клетки типа II генерируют потенциалы действия (ПД) (50-60 мВ), который обеспечивает надежный выброс АТР, превышая порог активации CALHM1 (Рис.3В). Кроме того, ПД придают квантовый характер секреции нейротрансмиттера, как в случае экзоцитозного механизма.

Рисунок 3. Потенциал-зависимый выброс АТР, детектируемый методом АТР-биосенсора. (А) Выброс АТР при деполяризации вкусовых клеток типа II 2х cекундными импульсами от поддерживаемого потенциала -70 мВ до 60 мВ с шагом 10 мВ. Символы – усредненные ответы АТР-биосенсора. Непрерывная кривая – расчетные данные, полученные на основе математической модели выброса АТР. (В) Выброс АТР при стимуляции клеток типа II 2х cекундной серией ПД-подобных импульсов (5 мс), варьируемых в пределах -60 ÷ 60 Мв.

Транскриптомный анализ, молекулярное клонирование и гетерологическая экспрессия сигнальных и канальных белков

Анализ экспрессии генов на уровне одиночных хемосенсорных клеток

Во многих тканях и органах популяция клеток гетерогенна и поэтому анализ транскриптома на уровне ткани не дает адекватную информацию о профиле экспрессии и коэкспрессии генов. Нами разработана методология анализа транскриптов генов в одиночных хемосенсорных клетках с использованием методов RNA амплификации и PCR с ген-специфичными праймерами (Рис. 4). В случае вкусовых клеток, которые не могут быть идентифицированы морфологически, разработаны физиологические критерии их идентификации с использованием методов patch clamp, Ca2+ imaging и трансгенных мышей. Проанализирован профиль экспрессии генов ряда рецепторных (T1R1-T1R3, CASR, GPRC6A), канальных (TRPM5, PKD2L1, Panx1, Cx 26 – Cx 45), сигнальных (gustducin, PLCb2) и других (SNAP-25, NTPD2) белков во вкусовых клетках, и изучено распределение транскриптов всех шести генов пероксиредоксинов на уровне одиночных обонятельных нейронов.

Рисунок 4. Методология транскриптомного анализа в одиночных клетках.

Пуринэргическая и холинергическая системы вкусовых клеток

Информационный процессинг во вкусовой почке обеспечивается межклеточными коммуникациями. Нами впервые показано, что таковые протекают при участии пуринергической и холинергической сигнальных систем. В частности, установлено, что вкусовые клетки экспрессируют множественные изоформы P2Y пуринорецепторов, включая P2Y1, P2Y2, P2Y4 и P2Y6, сопряженные с фосфоинозитидным каскадом, мобилизацией депонированного Са2+ и активацией Са2+-зависимых Cl- каналов. Получены биофизические и фармакологические свидетельства, что во вкусовых клетках P2Y2 и P2Y4 рецепторы формируют гомо- и гетеродимеры. Установлено, что субпопуляция вкусовых клеток типа I экспрессирует мускариновые рецепторы ацетилхолина (М1, М3 и М5 изоформы), сопряженные с фосфоинозитидным каскадом и мобилизацией Са2+.

Молекулярное клонирование и гетерологическая экспрессия

Для решения задач клеточной физиологии был клонирован ряд рецепторных (CASR, GPRC6A, 5-HT2C, P2Y11, PAR1) и канальных белков (TRPM5, TRPC2, PKD2L1, Panx1, P2X2, P2X3, TMEM16A, TMEM16B), которые затем гетерологически экспрессировались в клетках HEK-293 и/или CHO для дальнейшего анализа их функциональных, биофизических и фармакологических свойств.

Са2+ сигнализация в мезенхимных клетках

Мезенхимные стромальные клетки (МСК), идентифицированные в ряде тканей – это гетерогенная клеточная популяция, самоподдерживающаяся за счет пролиферации и способная к дифференцировке в клетки опорных и соединительных тканей. По свои специфическим и во многом уникальным биологическим свойствам МСК обладают большим терапевтическим потенциалом для регенеративной медицины.

Рисунок 5. Модель трансдукции агонистов в МСК. Связывание агониста с рецептором стимулирует продукцию DAG and IP3 за счет гидролиза PIP2 фосфолипазой С. Последующая активация специализированных IP3 рецепторов (IP3Rgrad) вызывает выброс Ca2+ и формирование локального Ca2+ сигнала, градуально зависящего от интенсивности стимуляции клетки (красная кривая). По достижению порогового уровня (пунктирная линия), локальный Са2+ сигнал стимулирует выброс Ca2+ из другого Ca2+ депо по механизму CICR. Это является основным механизмом усиления в каскаде трансдукции и обеспечивает генерацию глобального Ca2+ signalа (голубая кривая).

При исследовании рецепторных и сигнальных систем МСК из жировой ткани человека нами было показано, что агонисты ряда гептаспиральных рецепторов (G-protein coupled receptor, GPCR) способны мобилизовать Са2+ в этих клетках. Специфической особенностью исследованной нами адренергической и пуринергической трансдукции в МСК было то, что Са2+ ответы на агонисты генерировались по принципу «все или ничего». Иными словами, последовательные аппликации агонистов либо не вызывали мобилизацию внутриклеточного Са2+, либо инициировали импульсное повышение Са2+ практически до одной и той же величины при разных концентрациях выше пороговой. Ряд фактов свидетельствовал о том, что адренергическая и пуринергическая трансдукция, скорее всего, протекает в МСК в две стадии. Вначале генерируется локальный Са2+ сигнал, градуально зависящий от концентрации агониста, который затем инициирует Са2+ индуцированный выброс депонированного Са2+ (Са2+-induced Са2+ release, CICR). Последний является пороговым, триггер-подобным регенеративный процессом, который может приводить к генерации глобального Са2+ сигнала, амплитуда которого слабо зависит от величины первоначального инициирующего Са2+ сигнала (Рис.5). Предложенная модель объясняет феноменологию Са2+ сигнализации, инициируемую агонистами в МСК, и, по-видимому, соответствует функциям этих клеток. Их основную физиологическую задачу можно сформулировать как «пороговую» – эти клетки должны находиться в самоподдерживающемся неактивном состоянии в ожидании адекватного сигнала, по получении которого МСК мигрируют в место повреждения ткани и дифференцируются в клетки нужного фенотипа. В этом случае пороговый тип сигнализации позволяет отсечь шум и воздействия, неадекватные по величине и продолжительности.

Рис.1. Взаимодействие родопсина с  ретиналем. Розовый – 11-cis, голубой – all-trans изомеры ретиналя,  основная цепь и остаток ретиналь-связывающий остаток Lys306 окрашены в желтый цвет для 11-cis ретиналь-родопсина, в синий для 11trans.

Рис.1. Электростатический потенциал цитохромов холестерин-метаболизирующего цитохрома P450 человека (слева), цитохрома Р450 – монооксигеназы жирных кислот из Ваcillus megaterium (в центре) и человеческого цитохрома P450 – гидролазы прогестерона (справа). Синий цвет – положительный потенциал, красный – отрицательный, белый – нейтральный.